克隆這個(gè)詞出現(xiàn)于20世紀(jì)初，其含義指由單個(gè)祖先個(gè)體經(jīng)過無性繁殖而產(chǎn)生的其他個(gè)體。下面小編整理了分子克隆技術(shù)論文，歡迎閱讀!

　　分子克隆技術(shù)論文篇一

　　水稻粒型基因克隆與分子育種研究進(jìn)展

　　摘要：水稻(Oryza sativa L.)粒型包括粒長、粒寬和長寬比，既是水稻外觀品質(zhì)之一，又通過影響粒重而影響產(chǎn)量，因此改良水稻粒型具有十分重要的意義。隨著功能基因組和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，越來越多的粒型基因被克隆，部分已經(jīng)開始應(yīng)用于育種實(shí)踐。綜述了水稻粒型基因的克隆、粒型基因之間的相互關(guān)系及其在分子育種中的應(yīng)用。以期為水稻育種提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)提供理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：水稻(Oryza sativa L.);粒型;基因克隆;分子育種

　　中圖分類號：S511;Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114(2014)13-2977-04

　　Cloning and Molecular Breeding of Grain Shape Genes of Rice

　　QIU Xian-jin1，YUAN Zhi-hua1，HE Wen-jing1，LIU Huan1，XU Jian-long1，2，XING Dan-ying1

　　(1. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China;

　　2. Institute of Crop Science， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Beijing 100081， China)

　　Abstract： Rice(Oryza sativa L.) grain shape including grain length， grain width， and length to width ratio is an important appearance quality and a factor affecting rice grain weight. With the development of functional genomics and moleculars markers in last decades， a number of grain shape genes have been cloned and used in molecular breeding of rice. This paper reviews the cloning of grain shape genes， the relationship amang these genes， and their applications in molecular breeding of rice. It will provide useful information for improving yield and quality of rice.

　　Key words： rice(Oryza sativa L.); grain shape; gene cloning; molecular breeding

　　水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是我國2/3以上人口的主食[1]。隨著我國人口的不斷增長和耕地面積的逐漸減小，糧食安全日益受到人們的重視[2，3]。從20世紀(jì)50年代開始，矮化育種和雜種優(yōu)勢利用使我國水稻單產(chǎn)大幅增長[4，5]。但是近20年來，我國水稻產(chǎn)量徘徊不前，迫切需要新的育種方法和技術(shù)來提高水稻產(chǎn)量[6]。水稻三因子中，粒重受環(huán)境影響最小，增加粒重對提高水稻單產(chǎn)具有十分重要的意義。

　　另外，隨著我國人民生活水平的不斷提高，人們對水稻品質(zhì)的要求也越來越高。如何將提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)有機(jī)地結(jié)合起來是育種家們要解決的重大課題。

　　粒型包括粒長、粒寬和長寬比，是水稻重要的外觀品質(zhì)，同時(shí)也通過影響粒重對水稻產(chǎn)量有很大影響[7]。此外，粒型與外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)也有十分密切的關(guān)系[8]。因此克隆水稻粒型基因，開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，通過分子育種改良水稻粒型，可以同時(shí)提高水稻產(chǎn)量和改良水稻品質(zhì)。本文從水稻粒型基因的克隆、粒型基因之間的相互關(guān)系和在分子育種中的應(yīng)用等方面，綜述了前人在粒型性狀遺傳與育種方面的研究成果，以期為水稻育種提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)提供參考依據(jù)。

　　1 水稻中已克隆的粒型基因

　　水稻粒型基因克隆有利于人們了解粒型性狀的發(fā)育過程和分子機(jī)制，幫助育種家進(jìn)行育種改良。隨著功能基因組學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，近年來研究者們用遺傳群體和突變體的方法克隆了許多粒型基因。

　　GS3是第一個(gè)克隆的粒型基因，它主要影響粒長、長寬比和粒重。Wan等[9]利用Asominori/IR24構(gòu)建的重組自交系將其定位到87.5 kb區(qū)間，后來Fan等[10]利用川7/明恢63構(gòu)建的回交群體將它精細(xì)定位于7.9 kb區(qū)間。GS3含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼一個(gè)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，其中OSR結(jié)構(gòu)域是粒長變短的必需結(jié)構(gòu)域，而VWFC結(jié)構(gòu)域在水稻生長發(fā)育過程中對OSR結(jié)構(gòu)域起抑制作用[11]。GS3第二個(gè)外顯子上的一個(gè)C突變成A是導(dǎo)致短粒變成長粒的根本原因，此外還有兩個(gè)SSR位點(diǎn)對粒長有影響[10-12]。GS3進(jìn)化起源于粳稻，在進(jìn)化歷程中滲透到秈稻中[13]。在漫長的馴化過程中，GS3受到了強(qiáng)烈的正向選擇。

　　GW2是第一個(gè)克隆的影響粒寬和粒重的主效基因，含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，編碼一個(gè)具有E3泛素連接酶活性的蛋白[14]。GW2在水稻中組成型表達(dá)，2個(gè)親本的表達(dá)量沒有差異，揭示2種等位基因?qū)α捰绊懙牟町惒皇潜磉_(dá)量的高低，而是翻譯蛋白功能的喪失，這與GS3很類似。窄粒等位基因由于一個(gè)點(diǎn)突變造成提前終止，編碼的蛋白失去功能，細(xì)胞數(shù)目增加，灌漿速度加快，最終導(dǎo)致谷粒變寬。WY3(研究所用窄粒親本)等位基因是一種稀有等位基因，在中國的核心種質(zhì)中含有這種等位基因的水稻品種很少[15]。 　　qSW5/GW5也是一個(gè)影響粒寬和粒重的主效基因，它通過影響穎殼細(xì)胞數(shù)目影響粒寬[16]。qSW5含有一個(gè)功能位點(diǎn)(Functional nucleotide polymorphisms，F(xiàn)NP)，日本晴的等位基因有1 212 bp的缺失。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，這段缺失與粒寬存在高度關(guān)聯(lián)，且在馴化過程中受到了選擇。qSW5/GW5編碼一個(gè)含有144個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有核定位信號和一個(gè)富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位顯示qSW5/GW5定位于細(xì)胞核內(nèi)。qSW5/GW5可以與泛素互作，通過參與蛋白質(zhì)降解途徑來影響粒寬[17]。qSW5/GW5負(fù)調(diào)控粒寬。

　　GS5也是一個(gè)影響粒寬和粒重的主效基因，編碼一個(gè)含有480個(gè)氨基酸的絲氨酸縮肽酶。關(guān)聯(lián)分析顯示該基因的啟動子區(qū)與粒寬有關(guān)聯(lián)，轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證也表明GS5通過表達(dá)量的變化來控制粒寬[18]。GS5正調(diào)控CDKA1、CAK1、CAK1A、CYCT1和H1這5個(gè)基因，在細(xì)胞周期中起到起始細(xì)胞分裂的作用，通過影響穎殼細(xì)胞數(shù)目來影響粒寬。與qSW5/GS5不同的是，GS5正調(diào)控粒寬。

　　與GS5相似，GW8也正調(diào)控粒寬和粒重[19]。GW8是OsSPL16，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，影響粒寬的功能區(qū)域也是啟動子區(qū)而非編碼區(qū)。GW8在組織的發(fā)育過程中表達(dá)，尤其是在7 cm穗部表達(dá)量最高。GW8通過調(diào)控細(xì)胞周期基因CDKA1、CYCD3和E2F2的表達(dá)來影響穎殼細(xì)胞數(shù)目，最終影響粒寬。在核心種質(zhì)中對該基因測序發(fā)現(xiàn)，窄粒等位基因比寬粒等位基因品質(zhì)好，因此通過GW8的選擇可以同時(shí)降低粒寬和改良外觀品質(zhì)。

　　GIF1編碼一個(gè)細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶，該基因突變使堊白增加，粒寬變寬[20]。FLO2含有一個(gè)三角形四肽結(jié)構(gòu)域，可能介導(dǎo)蛋白質(zhì)互作[21]。FLO2突變導(dǎo)致粒長變短，粒寬變窄。SRS3含有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子，編碼蛋白激酶13亞家族的一個(gè)蛋白[22]。這個(gè)基因突變導(dǎo)致粒型變得短圓，粒重下降。DEP2/EP2/SRS1編碼一個(gè)功能未知的植物特有蛋白，主要在幼嫩組織中表達(dá)，且在幼穗中表達(dá)量最高[23-25]。該基因主要影響穗軸及一次和二次枝梗的伸長，不影響穗原基的發(fā)生，并通過影響穎殼細(xì)胞形狀而非細(xì)胞數(shù)目而最終影響粒型。該基因突變后，穗部直立，粒型變得短圓。SRS5基因編碼α微管蛋白，在水稻中為組成型表達(dá)，但是在幼穗中表達(dá)量最高，并隨著幼穗的發(fā)育其表達(dá)量上升，通過影響穎殼細(xì)胞的長度來影響粒型[26]。EP3編碼一個(gè)含515個(gè)氨基酸組成的F結(jié)構(gòu)域蛋白突變后導(dǎo)致穗長、分蘗數(shù)、每穗穎花數(shù)、育性、長寬比減小，但增加了最小維管束的數(shù)量和穗軸的厚度[27]。PGL1和PGL2都編碼bHLH蛋白，都是通過抑制ANTAGONIST OF PGL1(APG)的表達(dá)發(fā)揮作用，而APG基因是水稻粒型的負(fù)調(diào)控因子。超表達(dá)這兩個(gè)基因后，穎殼細(xì)胞長度增加，粒長和粒重增加[28，29]。

　　2 粒型基因之間的關(guān)系

　　目前已經(jīng)克隆了一些粒型基因，它們的克隆為分子標(biāo)記輔助選擇提高水稻產(chǎn)量和改良品質(zhì)提供了非常大的幫助。但是，由于上位性作用，聚合這些基因的結(jié)果很難預(yù)測。因此，除了克隆粒型新基因，了解粒型基因的分子機(jī)理外，還需要弄清楚哪種等位基因最有利，以及各個(gè)基因之間的相互關(guān)系。

　　Yan等[30]分別構(gòu)建GS3 RNAi轉(zhuǎn)基因材料、GW2 RNAi轉(zhuǎn)基因材料和以Habataki為供體，Sasanishiki為受體的qSW5的染色體片段代換系三套遺傳材料，用來驗(yàn)證這3個(gè)基因的功能，同時(shí)探究它們之間的相互關(guān)系。結(jié)果表明，在調(diào)控路徑上GW2位于qSW5基因的上游，同時(shí)和qSW5一起正調(diào)控GS3，GIF1受GS3和GW2負(fù)調(diào)控以及qSW5正調(diào)控，且GS3和qSW5不同等位基因之間的效應(yīng)會相互掩蓋。該研究較系統(tǒng)地描述了粒型主效基因之間的相互關(guān)系，為后續(xù)分子標(biāo)記輔助選擇聚合粒型基因提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。

　　3 粒型基因在分子育種中的應(yīng)用

　　目前，水稻中克隆的粒型基因越來越多，為育種家提供了豐富的基因資源。其中GS3、GW5/qSW5、GS5和GW8被證實(shí)在水稻馴化歷程中受到了嚴(yán)格的選擇與淘汰。在水稻常規(guī)育種中已經(jīng)廣泛地使用了這些基因，目前很多育成品種的粒型都得到了很大的改良。但是，這種育種方法沒有針對性，延長了育種年限，降低了育種家選出優(yōu)良品種的幾率。因此，在水稻育種中，開發(fā)這些基因的功能標(biāo)記，針對這些基因進(jìn)行分子育種，將會加快育種進(jìn)度，便于育種家更快速有效地選擇到理想的品種。

　　Fan等[31]針對GS3的功能位點(diǎn)(C/A)設(shè)計(jì)了一個(gè)CAPs標(biāo)記，并用該標(biāo)記分析了180份核心種質(zhì)，該標(biāo)記能很好地區(qū)分GS3的兩種等位基因。Ramkumar等[32]也針對該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一個(gè)基于PCR的引物。該標(biāo)記極大地降低了成本，可以用于較大規(guī)模地篩選目標(biāo)基因。Wang等[12]又在GS3的第四個(gè)外顯子和第五個(gè)內(nèi)含子處發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與粒長相關(guān)的位點(diǎn)，并針對這2個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的標(biāo)記。Yan等[33]根據(jù)GW2基因中1 bp的缺失設(shè)計(jì)了一個(gè)dCAPs標(biāo)記，研究者也根據(jù)GW5/qSW5基因的1.2 kb缺失開發(fā)了功能標(biāo)記[16，17，30]。這些標(biāo)記的開發(fā)，都為分子育種選擇粒型提供了標(biāo)記的基礎(chǔ)。

　　楊梯豐等[34]用以華粳秈74為受體、IR64為供體的單片段代換系，分析了GS3在單片段代換系下的遺傳效應(yīng)及與其他幾個(gè)千粒重、粒寬、香味和抽穗期基因的聚合效應(yīng)。結(jié)果表明，IR64的GS3導(dǎo)入到華粳秈74后，無論是單片段代換系還是聚合材料，粒長均增加，說明來源于IR64的GS3能夠表現(xiàn)出增加粒長的效應(yīng)。同時(shí)，其他幾個(gè)基因不會對GS3產(chǎn)生上位性效應(yīng)，GS3的基因效應(yīng)在代換系和聚合材料中都能穩(wěn)定表達(dá)。

　　張劍霞[35]用分子標(biāo)記輔助選擇的方法將長粒型等位基因的GS3和Xa23聚合到珍汕97B中，使粒長由原來的8.0 mm增長到9.81 mm，改良的效果十分明顯。Wang等[36，37]分別將93-11的GS3和qHD8、qGHD7、qHD6.1、Wx和一個(gè)控制葉形的QTL(qFL1)導(dǎo)入到珍汕97B中，并進(jìn)行基因聚合來改良珍汕97B的農(nóng)藝性狀。結(jié)果表明，改良后的珍汕97B粒長由原來的8.3 mm增加到9.2 mm，粒寬由原來的3.2 mm減小到2.9 mm，千粒重由原來的25.2 g增加到27.2 g。Wang等[19]將窄粒型等位基因的GW8與長粒型等位基因的GS3聚合到HJX74中，結(jié)果粒長增長，粒寬減小，產(chǎn)量基本不變，培育出了一個(gè)新品種Huabiao1。 　　4 展望

　　我國水稻育種經(jīng)歷了綠色革命和雜種優(yōu)勢利用這兩個(gè)大的革新，水稻單產(chǎn)有了非常大的提高。但是隨著人口的增長，水稻產(chǎn)量還需要進(jìn)一步提高。同時(shí)，隨著人們生活水平的提高，稻米品質(zhì)越來越受到人們的重視。為了在提高單產(chǎn)的同時(shí)能改良水稻品質(zhì)，水稻粒型的改良是最直接簡單的方法。隨著功能基因組和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，研究者們克隆了越來越多的粒型基因，未來將會有更多粒型基因得到克隆，它們的分子機(jī)理也會得到進(jìn)一步闡明。

　　目前水稻粒型分子育種中只有GS3得到了廣泛應(yīng)用，大部分粒型基因的利用目前僅限于傳統(tǒng)育種，主要原因是針對這些基因的功能標(biāo)記技術(shù)還有待開發(fā)，或者是開發(fā)出來的功能標(biāo)記技術(shù)使用成本較高。相信在不久的將來，研究者們會開發(fā)出更多更好的功能標(biāo)記技術(shù)，粒型育種將會更加快速簡便。

　　另外，隨著越來越多粒型基因的定位與克隆，人們面臨的另一個(gè)問題是如何更加有效地選擇和利用這些基因。弄清粒型基因之間的相互關(guān)系，粒型基因?qū)ζ渌誀畹挠绊懸彩且粋€(gè)很重要的議題。搞清楚這些基因的關(guān)系，從中選擇最優(yōu)良的基因進(jìn)行粒型育種，也能極大地縮短育種進(jìn)程，增加選育出優(yōu)良品種的幾率，提高育種效率。

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