“限制酶”是高考試題中命題頻率較高的知識(shí)點(diǎn)，也是高考備考的核心知識(shí)點(diǎn)。下面結(jié)合典型試題，對(duì)相關(guān)知識(shí)進(jìn)行歸納和整合，希望能對(duì)廣大考生的復(fù)習(xí)備考有所裨益。

　　一、酶切結(jié)果的推導(dǎo)

　　限制酶作為酶類，決定其催化作用具有高效性、專一性和作用條件溫和等特點(diǎn)。其中專一性的具體表現(xiàn)為：某種限制酶只能催化DNA上特定序列特定位點(diǎn)的磷酸二脂鍵水解，結(jié)果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。限制酶所識(shí)別的雙鏈DNA上的序列具有“回文對(duì)稱”性質(zhì)，即無論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)，即錯(cuò)位平切，產(chǎn)生的是黏性末端;當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，即平切，產(chǎn)生平末端。錯(cuò)位切的限制酶在基因工程中最常使用，因?yàn)榕c平末端相比較，黏性末端更有利于DNA片段的連接。

　　例1下面是5種限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA分子的識(shí)別序列和剪切位點(diǎn)圖(↓表示剪切點(diǎn)、切出的斷面為黏性末端)：限制酶1：——↓GATC——;限制酶2：——CATG↓——;限制酶3：——G↓GATCC——;限制酶4：——CCGC↓GG——;限制酶5：——↓CCAGG——。請(qǐng)指出下列哪組表達(dá)正確( )

　　A.限制酶2和4識(shí)別的序列都包含4個(gè)堿基對(duì)

　　B.限制酶3和5識(shí)別的序列都包含5個(gè)堿基對(duì)

　　C.限制酶1和3剪出的黏性末端相同

　　D.限制酶1和2剪出的黏性末端相同

　　解析：限制酶2、3、4、5識(shí)別的序列分別包括4個(gè)、6個(gè)、6個(gè)、5個(gè)堿基對(duì)，故A、B錯(cuò)。限制酶1和2切割產(chǎn)生的黏性末端不同。限制酶1剪出的黏性末端是：—C T A G，限制酶2剪出的黏性末端是：—C A T G，限制酶3切割產(chǎn)生的黏性末端是:—C T A G，故D錯(cuò)。

　　答案 C

　　二、酶切方法的選擇

　　構(gòu)建重組質(zhì)粒，需要用限制酶分別切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，切割方法主要有單酶切和雙酶切。單酶切是指用同一種限制酶對(duì)含目的基因的DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割，目的基因序列的兩邊必須各有一個(gè)能被該限制酶識(shí)別的序列及切點(diǎn)，而質(zhì)粒至少有一個(gè)識(shí)別序列及切點(diǎn)，這樣被切割的質(zhì)粒與切下的目的基因兩邊形成相同的黏性末端，以實(shí)現(xiàn)連接而形成重組質(zhì)粒，有時(shí)也可以用兩種不同的限制酶(同尾酶)切割產(chǎn)生相同的黏性末端。雙酶切是指用兩種限制酶進(jìn)行切割，含目的基因的DNA和質(zhì)粒上都必須有能被這兩種限制酶識(shí)別的序列及切點(diǎn)，結(jié)果兩者都會(huì)產(chǎn)生具有兩種不同的黏性末端的DNA片段，兩個(gè)末端分別用A與B表示，然后混合起來，那么載體分子的A端與目的基因的A端連接，載體分子的B端與目的基因的B端連接，形成重組DNA分子，這樣就可以避免DNA連接酶催化時(shí)被切割后的質(zhì)粒自連成環(huán)的現(xiàn)象，并能保證質(zhì)粒與目的基因的定向連接。

　　例2基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶I的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是-↓GATC-。根據(jù)圖示,判斷下列操作正確的是( )

　　A.質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割

　　B.質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割

　　C.目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅰ切割

　　D.目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割

　　解析：在切割質(zhì)粒時(shí)應(yīng)遵循一個(gè)原則：不能同時(shí)將兩個(gè)標(biāo)記基因切開，至少保留一個(gè)，所以只能用酶Ⅰ切割，而從目的基因兩側(cè)堿基序列可知，只能用酶Ⅱ才得到含目的基因的DNA片段。

　　答案：A

　　例3如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性核酸內(nèi)切酶,SmaⅠ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是——C↓CCGGG—。下列說法錯(cuò)誤的是(　　)

　　A.圖中質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有0、2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)

　　B.要用PstⅠ和EcoRⅠ這兩種限制酶分別去切割含抗原基因的DNA、質(zhì)粒

　　C.對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越低

　　D.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來

　　解析:因?yàn)樵撡|(zhì)粒為環(huán)狀，所以在沒有經(jīng)過SmaⅠ切割前，其不含游離的磷酸基團(tuán)，當(dāng)被SmaⅠ酶切割后該質(zhì)粒變成以一條DNA分子，含有兩條單鏈，而在每條單鏈的5′端會(huì)都含有一個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。構(gòu)建過程中需要將目的基因完整切割下來，此時(shí)要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，質(zhì)粒的切割也要用這兩種限制酶，與只使用一種限制酶相比較，其優(yōu)點(diǎn)在于能防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，同時(shí)確保構(gòu)建的重組質(zhì)粒只有一種。因?yàn)閷?duì)該該質(zhì)粒進(jìn)行改造是只插入SmaⅠ酶切位點(diǎn)，相對(duì)于質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性而言，含有的C-G堿基對(duì)越多，則所含的氫鍵越多，其熱穩(wěn)定性越高?？箍敲顾鼗蚴菢?biāo)記基因，目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細(xì)胞。

　　答案:C

　　三、酶切圖譜的構(gòu)建

　　酶切圖譜是指選取某一特定長度的DNA分子，用多種限制酶單獨(dú)或聯(lián)合切割，再通過電泳技術(shù)將酶切片段進(jìn)行分離，計(jì)算相對(duì)大小，以確定每一種限制酶在DNA分子中的切點(diǎn)位置和相對(duì)距離，并據(jù)此繪制而成的物理圖譜(一般以直線或環(huán)狀圖式表示)。

　　例4用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ單獨(dú)或聯(lián)合切割同一種質(zhì)粒，得到的DNA片段長度如下圖(1kb即1000個(gè)堿基對(duì))，請(qǐng)?jiān)谙聢D中畫出質(zhì)粒上EcoRⅤ、MboⅠ的切割位點(diǎn)。

　　解析：分析題中圖解可知，用EcoRⅤ切割質(zhì)粒只得到長度為14 kb的一個(gè)片段，說明該酶在質(zhì)粒上只有1個(gè)切點(diǎn);同理可以推測MboⅠ在質(zhì)粒上有2個(gè)切點(diǎn);由圖中可以看出同時(shí)用兩種限制酶切割時(shí)得到了3個(gè)片段，由此可以推測限制酶EcoRⅤ的切點(diǎn)在圖中11.5 kb的DNA片段中。具體切割位點(diǎn)見答案。

　　答案：見右圖：

　　變式訓(xùn)練

　　1.下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是( )

　　A.①②　　 　 B.②③　　 　C.③④　 　 　D.②④

　　答案：D

　　2.在DNA測序工作中，需要將某些限制酶的限制位點(diǎn)在DNA上定位，使其成為DNA分子中的物理參照點(diǎn)，這項(xiàng)工作稱為“限制酶圖譜的構(gòu)建”?，F(xiàn)用限制酶HindⅢ、BamHI以及二者的混合物分別降解一個(gè)4kb(1kb即1千個(gè)堿基對(duì))大小的線性DNA分子，然后通過某種方法將獲得的不同長度的DNA片段分開，結(jié)果如下圖所示：

　　據(jù)此分析，這兩種限制酶在該DNA分子上的限制位點(diǎn)數(shù)目是以下哪一組( )

　　A.HindⅢl個(gè)，BamHI2個(gè) B.HindⅢ2個(gè)，BamHI3個(gè)

　　C.HindⅢ2個(gè)，BamHI1個(gè) D.HindⅢ和BamHI各有2個(gè)

　　答案：A

　　3.圖1表示含有目的基因D的DNA片段長度(bp即堿基對(duì))和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列。現(xiàn)有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4種限制性核酸內(nèi)切酶，它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。請(qǐng)回答下列問題

　　(1)圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個(gè)堿基之間依次由 連接。

　　(2)若用限制酶SmaI完全切割圖1中DNA片段，產(chǎn)生的末端是 末端，其產(chǎn)物長度為 。

　　(3)若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對(duì)被T-A堿基對(duì)替換，那么基因D就突變?yōu)榛騞。從雜合子中分離出圖1及其對(duì)應(yīng)的DNA片段，用限制酶Sma I完全切割，產(chǎn)物中共有 種不同長度的DNA片段。

　　(4)若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制酶是 。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般需要用添加 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)檢測，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá)，其最可能的原因是 。

　　答案:(1)脫氧核糖、磷酸、脫氧核糖(2)平 537bp、790bp、661bp (3)4

　　(4)BamH I 抗生素B 同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質(zhì)粒反向鏈接