關(guān)于pcr技術(shù)論文

　　PCR技術(shù)是一種體外酶促合成、擴增特定DNA片段的方法。下面是學(xué)習(xí)啦小編整理的關(guān)于pcr技術(shù)論文，希望你能從中得到感悟!

　　關(guān)于pcr技術(shù)論文篇一

　　技術(shù)的研究進展

　　摘要 PCR技術(shù)是一種體外酶促合成、擴增特定DNA片段的方法。因其高強的特異性和靈敏度以及檢測速度快、準確性好等優(yōu)點，已被廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)、微生物檢測等許多領(lǐng)域。該文從PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用方面進行了綜述，并對其發(fā)展做出了展望。

　　關(guān)鍵詞 PCR技術(shù);研究進展;應(yīng)用

　　中圖分類號 Q819 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739(2012)10-0047-02

　　PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶鏈式反應(yīng)，它是一種體外酶促合成，擴增特定DNA片段的方法。1985年，美國Karray等學(xué)者首創(chuàng)了PCR技術(shù)，并由美國Cetus公司開發(fā)研制[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和突破，PCR技術(shù)已在多個領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用，如微生物檢測、獸醫(yī)學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。由于該技術(shù)具有較強的靈敏度、準確度和特異性，又能快速進行檢測，因而其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷延伸[2-3]。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出了許多技術(shù)，如多重PCR(mutiplex PCR)技術(shù)[4]、實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)[5]、單分子PCR技術(shù)[6]。

　　1 PCR技術(shù)原理

　　PCR技術(shù)是根據(jù)待擴增的已知DNA片段序列、人工合成與該DNA 2條鏈末端互補的2段寡核苷酸引物，在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促作用下進行擴增。PCR的整個技術(shù)過程經(jīng)若干個循環(huán)組成，一個循環(huán)包括連續(xù)的3個步驟：第1步是高溫條件下的DNA模板變性，即模板DNA在93~94 ℃的條件下變性解鏈;第2步是退火，即人工合成的2個寡核苷酸引物與模板DNA鏈3’端經(jīng)降溫至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4種dNTP底物同時存在的情況下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物鏈將沿著5’-3’方向延伸與模板互補的新鏈[7]。經(jīng)過這個循環(huán)后，合成了新鏈，可將其作為DNA模板繼續(xù)反應(yīng)，由此循環(huán)進行。循環(huán)進程中，擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)級方式增加，一般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次，DNA可擴增l00萬~200萬倍[1]。PCR反應(yīng)的步驟很簡單，但是具體的操作是復(fù)雜的，如退火溫度的確定、延伸時間的長短以及循環(huán)數(shù)等。因此，不同的反應(yīng)體系應(yīng)該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，以避免假陰性或假陽性等情況的產(chǎn)生。

　　2 PCR技術(shù)的分類

　　在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)人們的需要以及各個領(lǐng)域的應(yīng)用要求，又衍生出很多種類的PCR技術(shù)。新技術(shù)在各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用并逐漸改進，為進一步的研究提供了基礎(chǔ)。

　　2.1 實時熒光定量PCR技術(shù)

　　1996年，學(xué)者經(jīng)過研究，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，首創(chuàng)了實時熒光定量PCR技術(shù)，新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)和其他基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。實時熒光定量PCR技術(shù)基于傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢，還具有實時性、準確性、無污染，實現(xiàn)了自動化操作和多重反應(yīng)，是PCR技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍[8]。

　　熒光定量PCR技術(shù)最大的特點是能將熒光基團加入到PCR反應(yīng)體系中，借助于熒光信號，累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[9]。實時監(jiān)測這一特點是常規(guī)PCR技術(shù)所不具有的，因為其對擴增反應(yīng)不能進行隨時的檢測。常規(guī)PCR技術(shù)的擴增終產(chǎn)物需要在凝膠電泳等條件下才能進行，無法對起始模板進行準確的定量，而熒光定量PCR技術(shù)的反應(yīng)進程可以根據(jù)熒光信號的變化做出準確的判斷[10-11]。一個PCR循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，定量PCR儀可以收集1個熒光強度信號，熒光信號強度的變化可以反映產(chǎn)物量的變化情況，這樣就可以得到1條熒光擴增曲線[12]。熒光信號在指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物熒光信號的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性對應(yīng)關(guān)系，然后進行定量分析[13]。

　　2.2 多重PCR技術(shù)

　　多重PCR(mutiplex PCR)技術(shù)是PCR技術(shù)的一種，為同一管中加入多對特異性引物，與PCR管內(nèi)的多個模板反應(yīng)，在一個PCR管中同時檢測多個目標DNA分子。多重PCR技術(shù)可以擴增一個物種的一個片段，也可以同時擴增多個物種的不同片段[14]。

　　在同一反應(yīng)體系中，多重PCR技術(shù)進行多個位點的特異性擴增時，引物間的配對、引物間的競爭性擴增等會對擴增效果產(chǎn)生重要影響。一方面，如果能選擇適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可極大地提高多重PCR的擴增效果[15]。主要包括退火溫度、退火及延伸時間、PCR緩沖液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提質(zhì)量也影響多重PCR擴增效率，如DNA抽提不干凈或降解都將影響PCR擴增效果[16]。

　　2.3 單分子PCR技術(shù)(SM-PCR)

　　單分子PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的，基本循環(huán)過程相同，但在反應(yīng)條件、模板數(shù)量、DNA 聚合酶選擇、引物設(shè)計方面具有不同點。該技術(shù)是以少量或單個DNA分子為模板進行的PCR[17]。

　　單分子PCR技術(shù)反應(yīng)中，DNA 模板濃度極低，這就要求模板有較高的質(zhì)量。因為這是試驗成敗的決定性因素。在設(shè)計引物時，應(yīng)該嚴格控制GC的含量和Tm值，同時盡量避免引物間存在可配對序列。在反應(yīng)混合物模板數(shù)極低的情況下，若引物之間存在少量配對序列，擴增時極易形成二聚體，使反應(yīng)無法進行，得不到所需要的產(chǎn)物[18]。由于單分子PCR技術(shù)反應(yīng)的變性溫度(96~98 ℃)大多比常規(guī)PCR技術(shù)(94 ℃)略高，因而對DNA 聚合酶熱穩(wěn)定性的要求也更加嚴格，需要有較好的熱穩(wěn)定性，以防止溫度過高而使其失活。其變性時間(5~15 s)、退火時間及延伸時間也短于常規(guī)PCR技術(shù)[17]。

　　3 PCR技術(shù)的應(yīng)用

　　3.1 PCR技術(shù)在水產(chǎn)上的應(yīng)用

　　基因表達是檢測某個基因在不同發(fā)育期或不同組織中的表達量變化，或受到某種試驗處理過程中的影響而出現(xiàn)表達量變化的情況。有學(xué)者應(yīng)用real-time PCR技術(shù)研究碳水化合物含量對翹嘴紅鲴糖代謝酶G6Pase、GK以及PEPCK表達量的影響[19-21]，研究結(jié)果可為翹嘴紅鲴飼料配方中的最合適糖含量提供理論依據(jù)。孫淑娜等[22]研究葉酸拮抗劑對斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2表達的影響，表明葉酸拮抗劑對早期胚胎的心臟發(fā)育影響較大，可導(dǎo)致斑馬魚心臟發(fā)育延遲及心臟形態(tài)異常，并下調(diào)斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2的表達，這可能是葉酸生物學(xué)活性受抑后導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的機制之一。Sawyer et al[23]以斑馬魚的未受精卵、胚胎、仔魚和成魚為研究材料，采用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測了P450aromA和P450aromB在不同組織的表達量，表明在各組織中均有2種基因的表達，但表達量顯著不同，呈現(xiàn)組織特異性。

　　3.2 PCR技術(shù)在微生物檢測上的應(yīng)用

　　1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法檢測了Leg-ionella類菌種和大腸類細菌，其結(jié)果是通過點對點方法固定的多聚dT尾捕捉探針和生物素標記的擴增DNA進行雜交來檢測的。張志東等檢測口蹄疫病毒(FMDV)持續(xù)性感染的帶毒動物，表明實時熒光定量PCR技術(shù)具有快速檢測、準確、客觀等優(yōu)勢，較優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]對PCR-ELISA的方法進行了評價，結(jié)果顯示，樣品中沙門氏菌的檢出率可以達到98%。

　　4 展望

　　傳統(tǒng)PCR技術(shù)以及衍生出來的新型PCR技術(shù)自面世以來，已被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。隨著技術(shù)方法的不斷改進與完善，熒光定量PCR技術(shù)將會逐漸完善并廣泛應(yīng)用。多重PCR技術(shù)在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)境微生物檢測中具有重要作用;未來的研究主要集中在去除食品抑制因子干擾、改進樣品前處理技術(shù)等方面，其次是整合應(yīng)用多重PCR與其他技術(shù)，必將在未來食品微生物檢測中有非常好的應(yīng)用前景。

　　5 參考文獻

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