關(guān)于pcr技術(shù)論文(2)
關(guān)于pcr技術(shù)論文
副標(biāo)題#關(guān)于pcr技術(shù)論文篇二
免疫―PCR技術(shù)研究進(jìn)展
摘要：綜述了免疫-PCR的進(jìn)展?fàn)顩r，包括PCR的基本原理、PCR的改進(jìn)、靈敏度、抗體/DNA marker連接物的制備、顯示系統(tǒng)、免疫PCR種類以及假陽性的控制等。
關(guān)鍵詞：免疫PCR 基本原理 靈敏度 PCR種類
中圖分類號(hào)：R446.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1004-7484(2011)18-0071-02
1992年Sano等人將免疫測(cè)定技術(shù)與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)結(jié)合，創(chuàng)建了一種全新的極其敏感的抗原分子檢測(cè)技術(shù)，即免疫―PCR。該技術(shù)正是運(yùn)用PCR的高度敏感性來放大抗原抗體反應(yīng)的特異性，這種靈敏程度使免疫檢測(cè)技術(shù)達(dá)到了一個(gè)新的高度?，F(xiàn)在將免疫―PCR技術(shù)研究進(jìn)展綜述如下：
1 免疫―PCR的基本原理
免疫―PCR主要由兩部分組成。第一部分是類似于普通酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的抗原抗體反應(yīng)，第二部分是常規(guī)的PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。免疫―PCR與ELISA的區(qū)別就在于ELlSA是以堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶來標(biāo)記抗體，用顏色反應(yīng)來表明陽性或陰性結(jié)果，而免疫―PCR則是以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標(biāo)記抗體，用PCR擴(kuò)增抗體所連接DNA，并進(jìn)行電泳檢測(cè)，因此可由PCR產(chǎn)物的量來反映抗原分子的量。免疫―PCR的關(guān)鍵之處就在于用一個(gè)連接分子將一段特定的DNA連接到抗體上，在抗原和DNA之間建立相對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而將對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)核酸的檢測(cè)。
2 免疫-PCR的靈敏度
Sano T等應(yīng)用免疫―PCR檢測(cè)包被在ELISA板上的牛血清白蛋白，比應(yīng)用堿性磷酸酶染色的ELISA法，在檢測(cè)靈敏度上大約增加×105，由于PCR的巨大擴(kuò)增能力和特異性，使得免疫―PCR技術(shù)靈敏度高于目前存在的任何抗原檢測(cè)系統(tǒng)，理論上可檢測(cè)單分子抗原。人甲狀腺刺激素(TSH)是評(píng)價(jià)甲狀腺功能的指標(biāo)，血標(biāo)本中正常濃度較低(5×10-12mmol/L，25×10-16mmol/L)，臨床一般用放射免疫測(cè)定超過了ELISA的檢測(cè)范圍。Hendrickson等用三明治夾心法免疫―PCR檢測(cè)TSH水平1fg(10-12mmol)。而用夾心法ELISA檢測(cè)水平[pg(10-16mol)前者靈敏度比后者高3個(gè)數(shù)量級(jí)。
3 免疫―PCR的改進(jìn)
雖然Sano PP等人構(gòu)建的免疫―PCR具有極高的靈敏度，但Sano所用的連接分子鏈親和素―蛋白A嵌合體還沒有商品化，因此限制了他在實(shí)際應(yīng)用中的廣泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗體取代Sano免疫―PCR系統(tǒng)中的抗體，用商品化的親和素代替鏈親和素―蛋白A嵌合體作為連接分了構(gòu)建了一個(gè)新的免疫―PCR系統(tǒng)。Ruzicka用此免疫―PCR系統(tǒng)檢測(cè)小鼠抗載脂蛋白E抗體，可以檢測(cè)出包被濃度為10fg/ml的E抗體。此外，Sano的免疫―PCR實(shí)驗(yàn)流程需要眾多的洗滌步驟，使實(shí)驗(yàn)過程相當(dāng)繁瑣，并需要大量的操作時(shí)間。Zhou等人對(duì)此作了改進(jìn)，他們用生物素化的二抗和游離鏈親和素作為連接分子進(jìn)行免疫-PCR實(shí)驗(yàn)，把每個(gè)步驟的洗滌次數(shù)從原先的7～15次減至3～5次，從而減少了操作時(shí)間，但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，用修飾過的抗原稀釋緩沖液代替Sano免疫―PCR中的TBS作為抗原稀釋液，它主要把TBS中胍的濃度調(diào)到2mmol/L，由此解決了抗原的溶解問題。Zhou檢測(cè)了人原癌基因ETS，檢測(cè)濃度可達(dá)9.6×1015mmol/L，是常規(guī)ELISA的10倍，與Sano的免疫―PCR系統(tǒng)相比，Ruzicka和Zhou所用的方法不需要特殊的試劑，生物素和親和素(鏈親和素)都已商品化，因此在實(shí)際操作中得到廣泛應(yīng)用。
4 免疫―PCR的種類
多抗原分析物免疫―PCR，就是同時(shí)檢測(cè)多種抗原。放射性同位素、熒光索、酶和化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記的抗體，已被開發(fā)用于多分析物的檢測(cè)，但來自不同標(biāo)記的重疊信號(hào)和掃描不同信號(hào)密度上的困難，使上述方法尚未試用，相對(duì)而言，DNA為多分析物區(qū)分提供了理想的分子標(biāo)記。大小不同的DNA分子可以通過電泳準(zhǔn)確、定量地區(qū)分。Hendrickson等用99個(gè)堿基的寡核甘酸標(biāo)記的HCG抗體、85個(gè)堿基寡核苷酸標(biāo)記的TsII抗體和55個(gè)堿基募核苷酸標(biāo)記，β―Cal抗體同時(shí)檢測(cè)HCC、TSH 、β―Cal3個(gè)分析物，而PCR擴(kuò)增時(shí)，3個(gè)寡核苷酸應(yīng)用一對(duì)引物，但產(chǎn)物分子質(zhì)量各為99bp、85bp、55bp，因而各個(gè)抗原得以鑒定，Zhou和Hendrickson分別談到單引物免疫―PCR，所謂單引物免疫―PCR，就是標(biāo)記抗體的DNA指示分子的兩側(cè)翼含相同的引物序列，可用單引物PCR擴(kuò)增。該法可提高PCR擴(kuò)增效率，且適于多抗原免疫-PCR。雙相免疫―PCR，就是同時(shí)檢測(cè)病原體抗原又檢測(cè)病體基因的免疫―PCR，其原理就是一對(duì)用于擴(kuò)增某病原體基因的引物，被人工加在標(biāo)記抗體的DNA marker的兩端，使二者共用一對(duì)引物，但產(chǎn)物分子量大小不同，達(dá)到免疫―PCR在檢測(cè)抗原的同時(shí)，又檢測(cè)了目的基因。總之，目前而言，免疫―PCR可分為單分析物免疫―PCR、多分析物免疫-PCR、單引物免疫-PCR以及雙和免疫-PCR。
5 展望
免疫―PCR作為一種抗原檢測(cè)系統(tǒng)，同時(shí)具有抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR的高靈敏度，適合于各種微量抗原的檢測(cè)，并可以直接檢測(cè)細(xì)胞上抗原。預(yù)先將抗體和標(biāo)記DNA偶聯(lián)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，并可同時(shí)檢測(cè)多種抗原。而標(biāo)記物和引物被設(shè)計(jì)為帶有親和配體，則可用常規(guī)ETISA法檢測(cè)，隨著免疫―PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展完善，免疫―PCR的功能將得到更充分的發(fā)展，新的標(biāo)記物和引物設(shè)計(jì)將擴(kuò)展可檢測(cè)分析的范圍，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性具有側(cè)鏈DNA標(biāo)記物的偶聯(lián)物能夠承擔(dān)的標(biāo)記物的檢測(cè)，產(chǎn)生更準(zhǔn)確的結(jié)果，相信不久就會(huì)有商品化的免疫―PCR試劑盒問世。
參考文獻(xiàn)
[1] Bortolin S,Christopoulos TS %26 Verhaegen m.Anal.Chem,1996;68:834～840.
[2] Van Gijlswijk RPM,et al.J Immunol Methods,1996,189:117～127.
[3] Kakizaki E,Yoskida T,Kawakami H,et al.Lett.Appl microbiol,1996,23(2):101～103.
[4] Hendrickson ER,Hatfield TM,Joerger RD,et al.Nucleic Acids res,1995,23(3):522～529.
[5] Maia M,Takahashis H,Adler K,et al.J Virol methods,1995,52(3):273～278.
[6] Sano T,Smith CL,Cantor CR.Science,1992,258(5079):120～122.
[7] Sanna PP,Weiss F,Samson ME,et aL.Proc.Natl Acad Sci uSA,1995,92:272～275.
[8] Numata Y,Matsumoto Y.Clin Chim.Acta.1997,259(1～2):169～176.
[9] Mweene AS,Okazaki K,Kide H,et al.Jpn J vet,Res,1996,44(3):165～174.
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