有關(guān)于醫(yī)學(xué)論文的范文特輯
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談姜黃素抗腫瘤的機(jī)制
姜黃素(Curcumin)是從姜科(Zingiberaceae)、天南星科(Araceae)一些植物的根莖中提取的一種黃色色素。它是酸性多酚類物質(zhì)或二酮類化合物(圖1)。姜黃素在傳統(tǒng)藥物起增效劑的作用。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗氧化、抗癌等作用。姜黃素可以直接抑制腫瘤的增生，也可以通過增加其他抗癌藥物的抗癌效力而抑制腫瘤。姜黃素為什么可以抗癌呢?近年來從分子、細(xì)胞和組織水平對姜黃素抗癌作用的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，這些研究發(fā)現(xiàn)：姜黃素可在藥物作用的靶位點(diǎn)、腫瘤細(xì)胞的信號傳遞、腫瘤細(xì)胞中某些基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)及酶活性、腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成、多藥耐藥性、增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷力等方面發(fā)揮抗癌作用。
1 姜黃素進(jìn)入腫瘤細(xì)胞及其對靶位點(diǎn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用
姜黃素發(fā)揮作用，首先要進(jìn)入細(xì)胞。姜黃素進(jìn)入細(xì)胞后，能增加藥物的靶位點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的基因、酶和蛋白質(zhì)表達(dá)。
1.1 腫瘤細(xì)胞攝取姜黃素
姜黃素能夠通過細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞，然后起細(xì)胞毒效應(yīng)的作用。Hsu等用高效液相色譜法(HPLC)測定姜黃素的防擴(kuò)散機(jī)制，定量研究細(xì)胞攝取姜黃素的功能。Chang等用HPLC定量測定人乳腺腺癌和導(dǎo)管癌分離出的三種人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435S和MCF-7(MichiganCancer Foundation-7)對姜黃素的攝取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著姜黃素劑量的增加，癌細(xì)胞攝取姜黃素顯示出劑量依賴性，抑制增殖和促進(jìn)凋亡與癌細(xì)胞攝取姜黃素相關(guān)。
1.2 增加藥物作用的靶位點(diǎn)
抗癌藥物通常通過識別腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原而與之結(jié)合，消滅腫瘤細(xì)胞。姜黃素可以增加腫瘤細(xì)胞表面藥物識別的靶位點(diǎn)，從而增加藥物的抗癌效用。王家智[3]發(fā)現(xiàn)伊立替康和姜黃素兩種藥物聯(lián)合使用對人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的抑制作用高于伊立替康單獨(dú)使用，其作用機(jī)制可能是姜黃素使LoVo細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶I的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)增加，增加伊立替康對LoVo細(xì)胞的作用靶位點(diǎn)。
1.3 調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號傳遞
轉(zhuǎn)化生長因子-/Smad蛋白是細(xì)胞信號傳遞的一種，即一旦受體與配體結(jié)合形成復(fù)合物后便被激活，受體激酶在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)直接磷酸化并激活特殊類型的轉(zhuǎn)錄因子Smad，進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)甲狀旁腺素相關(guān)肽(peptide parathyroidhormone-related protein, PTHrP)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(ETwenty-Six-1, ETS-1)等蛋白質(zhì)表達(dá)。姜黃素能抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-刺激的PTHrP的分泌，磷酸化的Smad2/3對TGF-信號反應(yīng)下降，ETS-1蛋白對p-38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase, MAPK)介導(dǎo)的TGF-信號無反應(yīng)。Wright等[4]用姜黃素處理接種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的小鼠，發(fā)現(xiàn)姜黃素阻止TGF-刺激的PTHrP的分泌，并且能阻斷乳腺癌細(xì)胞的Smad信號。另一方面，研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠增強(qiáng)Nrf2(核轉(zhuǎn)錄因子)信號通路而起抑癌作用。Das等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)了姜黃素通過激活Nrf2信號預(yù)防癌癥。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素協(xié)同其他化療藥物共同抗腫瘤的機(jī)制是通過增加原抗癌藥物的磷脂酰肌醇3-激酶/ 蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinase/protein-serine- threonine kinase, PI3K/AKT)信號通路調(diào)控作用而實(shí)現(xiàn)的。PI3K/AKT信號通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞的PI3K/AKT信號調(diào)控往往出現(xiàn)異常而使其有過強(qiáng)的生長增殖能力。表柔比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)均是抗癌藥物，姜黃素聯(lián)合5-FU或表柔比星使用能大大增加其抗癌能力。金萌[6]用HepG2肝癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5diphenyl tetrazolium, 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法]，反轉(zhuǎn)錄PCR和Western-Blot分別檢測細(xì)胞存活率。武博榮用也相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均發(fā)現(xiàn)了姜黃素是5-FU、表柔比星抑制癌細(xì)胞生長的增敏劑，姜黃素聯(lián)合5-FU或表柔比星降低了AKT的表達(dá)水平，從而對HepG2細(xì)胞P13K/AKT信號通路實(shí)現(xiàn)調(diào)控。武博榮還確定了降低細(xì)胞生存率的最有效濃度配比是姜黃素(20 mol/L)聯(lián)合表柔比星(2 mol/m1)。當(dāng)姜黃素進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，即可調(diào)節(jié)細(xì)胞中某些酶活性及蛋白質(zhì)、基因的表達(dá)。
2 調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中某些酶活性、蛋白質(zhì)、基因的表達(dá)
蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)主要承擔(dān)者，而酶是細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)的催化劑。某些酶或其他蛋白質(zhì)過度表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速增殖。姜黃素能夠抑制某些蛋白質(zhì)的表達(dá)及酶的活性、增加抗氧化酶活性等。
2.1 抑制某些蛋白質(zhì)的表達(dá)及酶的活性
組蛋白去甲基JMJD2A、JMJD2B和JMJD2C過表達(dá)是大多數(shù)結(jié)腸腫瘤生長的重要原因。姜黃素能夠抑制JMJD2酶的活性。Kim等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，JMJD2C的表達(dá)下調(diào)能夠減少HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞的生長能力。姜黃素作為JMJD2酶的體外抑制劑的衍生物，可降低體內(nèi)JMJD2酶的活性。李燕通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor 1 , HIF-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9, MMP-9)的表達(dá)及其啟動(dòng)子的活性，表明姜黃素能阻止某些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄過程而抑制該蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤生長。
藥物代謝酶可以影響機(jī)體對藥物的吸收、藥物代謝速度等。姜黃素與某些抗癌藥物聯(lián)合使用，進(jìn)入體內(nèi)受到藥物代謝酶代謝轉(zhuǎn)化的同時(shí)，也可調(diào)節(jié)或抑制某些藥物代謝酶的表達(dá)水平和代謝活性，從而增加治療效果。Liu等在實(shí)驗(yàn)中將小鼠分成正常對照、苯并芘[benzo(a)pyrene, BP, 是一種致癌物]處理、BP+姜黃素處理、BP+白藜蘆醇處理，和BP +姜黃素+白藜蘆醇處理五組。BP單劑量處理后觀察到在小鼠的肺中藥物代謝酶，即細(xì)胞色素酶CYP及細(xì)胞色素b5酶活性顯著增加。對BP處理過的小鼠施加姜黃素和白藜蘆醇處理，發(fā)現(xiàn)比其他組顯著降低藥物代謝酶活性。Liu等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，姜黃素和槲皮素組合能夠顯著減少藥物代謝酶活性，從而起抑癌作用。羰基還原酶1(carbonyl reductase 1, CBR1)能夠還原代謝抗腫瘤藥物如柔紅霉素(Dau NorubicinRubidomycin, DNR)、阿霉素(Doxorubicin, DOX)等，降低抗腫瘤藥物的效力，且CBR1的表達(dá)量隨著抗腫瘤藥物劑量的增加而增加。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素是一種CBR1抑制劑，能與CBR1緊密結(jié)合。Hintzpeter等[12]通過分子建模發(fā)現(xiàn)姜黃素占據(jù)CBR1的輔因子結(jié)合位點(diǎn)，抑制CBR1還原裂解能力，結(jié)果表明，姜黃素與柔紅霉素共同使用可以減少A549細(xì)胞中柔紅霉素的還原裂解，從而增加其在癌組織中的功效。
蛋白激酶(磷酸化酶b激酶, PBK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞分裂旺盛的組織中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)。張生軍體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素可以結(jié)合PBK，并抑制PBK的活性，從而起到抗結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖的作用。
2.2 增加抗氧化酶活性
核因子-B(nuclear factor-B, NF-B)是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，對細(xì)胞增殖、凋亡和惡性腫瘤有重要作用。活性氧(reactive oxygen species, ROS)是NF-B最重要的調(diào)節(jié)因子之一。細(xì)胞內(nèi)活性氧主要受內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)控。正常細(xì)胞中NF-B的活化和信號傳遞被抗氧化酶抑制并進(jìn)一步誘導(dǎo)抗氧化酶的活性。在腫瘤細(xì)胞中代謝活動(dòng)的增強(qiáng)導(dǎo)致了氧化應(yīng)激，其進(jìn)一步增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的損耗，且引起NF-B的活化進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。Das等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素經(jīng)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，增強(qiáng)抗氧化酶活性而調(diào)節(jié)NF-B活性和氧化應(yīng)激，破壞ROS產(chǎn)生的惡性循環(huán)，破壞腫瘤生長的高氧化性微環(huán)境。Das等也發(fā)現(xiàn)姜黃素預(yù)防癌癥是通過增加二期抗氧化酶如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)、NQO1(Quinone oxidoreductase, 醌氧化還原酶)的活性而實(shí)現(xiàn)的。Liu等發(fā)現(xiàn)姜黃素和白藜蘆醇或和槲皮素組合使用時(shí)，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)、GST等抗氧化酶的活性增加，細(xì)胞中ROS水平降低，從而增加抗癌藥物白藜蘆醇和槲皮素的抗腫瘤效力。
2.3 恢復(fù)腫瘤抑制基因的功能
腫瘤抑制基因包括Rb基因、p 5 3 基因、p14ARF基因等。腫瘤抑制基因的功能丟失，細(xì)胞周期則失去控制，細(xì)胞過度增殖，表現(xiàn)出細(xì)胞癌性。Das等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)了在T細(xì)胞淋巴瘤小鼠肝臟氧化腫瘤微環(huán)境中，姜黃素能夠恢復(fù)腫瘤抑制因子p53水平而達(dá)到抑癌效果的。王原等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過對皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞的CDH1基因(編碼E-cadherin)和p14ARF基因的去甲基化作用而抑制SCL-1細(xì)胞增殖。當(dāng)姜黃素調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中某些基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)及酶活性后，即可對腫瘤細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞發(fā)揮作用。
3 姜黃素對腫瘤細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的作用
姜黃素可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，增強(qiáng)天然殺傷細(xì)胞的作用。
3.1 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖
正常細(xì)胞的分裂與增殖受到嚴(yán)格調(diào)控，惡性腫瘤細(xì)胞的分裂速度加快，生長與增殖失控。姜黃素可以將腫瘤細(xì)胞的分裂增殖阻斷在間期的G期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Hsu等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖。張海燕研究發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制宮頸癌細(xì)胞增殖具有劑量依賴性。Chang等通過對從人乳腺腺癌和導(dǎo)管癌中分離的三種細(xì)胞的研究，也發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖。李旭等發(fā)現(xiàn)姜黃素和吉西他濱均可抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖，且二者具有協(xié)同作用。邱偉等[18]運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)及Western blotting等方法發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，可能是通過下調(diào)侵襲相關(guān)分子MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)、MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的表達(dá)而起抑制作用的。
3.2 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡
腫瘤細(xì)胞中有一系列的癌基因過量表達(dá)，其產(chǎn)物可以阻斷腫瘤細(xì)胞凋亡，使其對凋亡誘導(dǎo)因子的敏感性降低，能夠逃逸凋亡機(jī)制，成為不死細(xì)胞。Hsu等用結(jié)腸直腸癌細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用表現(xiàn)出劑量依賴性，促進(jìn)凋亡似乎與細(xì)胞攝取姜黃素相關(guān)。范雙娜用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，用免疫細(xì)胞化學(xué)及Western Blot技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)中Bcl-2(B-cell lymphoma-2，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因，是一種原癌基因)蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，姜黃素可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。張海燕通過對姜黃素對SiHa、Caski、HeLa-S3和HeLa229四種宮頸癌細(xì)胞核和SiHa小鼠體內(nèi)移植瘤模型的細(xì)胞凋亡作用的研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡，但不影響正常宮頸上皮細(xì)胞的生存，且其可能是通過非caspase依賴的細(xì)胞死亡途徑實(shí)現(xiàn)的。Chang等用HPLC定量測定姜黃素對細(xì)胞凋亡的活化作用，結(jié)果也表明姜黃素激活腫瘤細(xì)胞的凋亡程序，且凋亡似乎與癌細(xì)胞攝取姜黃素相關(guān)。丁志山等用雞胚絨毛尿囊膜模型，用電子顯微鏡及熒光激活細(xì)胞分離儀(fluorescence activated cell sorter, FACS)觀察SMMC-7721細(xì)胞的凋亡，結(jié)果表明20 mmo/L的姜黃素即可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。
目前有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還可以增加其他抗腫瘤藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，從而提高藥物治療效果。杜琴等[21]實(shí)驗(yàn)中用MTT法檢測細(xì)胞增殖，F(xiàn)ACS監(jiān)測細(xì)胞凋亡，Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化，比色法測定細(xì)胞凋亡核心成員Ceaspase-3、Ceaspase-8、Ceaspase-9酶活性，Western blot法檢測該蛋白酶切割底物DNA修復(fù)酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)。結(jié)果表明，白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素使用對SMMC-7721肝癌細(xì)胞的促凋亡作用比白藜蘆醇單獨(dú)使用要強(qiáng)。Sreenivasan等實(shí)驗(yàn)中用中值效應(yīng)/等效線圖解法和組合指數(shù)值來表征姜黃素與藥物如卡鉑或依托泊苷或長春新堿聯(lián)合使用比藥物單獨(dú)使用增加人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)癌細(xì)胞系凋亡的作用效果更強(qiáng)，表明姜黃素增加RB細(xì)胞對化療藥物的敏感度，與其他抗腫瘤藥物在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡上具有協(xié)同作用。李旭等采用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素和吉西他濱協(xié)同促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡。
劉小紅實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素通過下調(diào)胃癌SGC-7901細(xì)胞中線粒體膜電位(mitochondrial membranepotential, MMP)誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡，也表明其誘導(dǎo)作用與位于線粒體上的ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP通道)的閉合狀態(tài)有關(guān)。
3.3 逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性
多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)是指腫瘤細(xì)胞對多種結(jié)構(gòu)不同，作用靶點(diǎn)不同的抗腫瘤藥物同時(shí)具有耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以逆轉(zhuǎn)腫瘤藥物的多藥耐藥性，有效地抑制腫瘤。李燕等用平板克隆形成和細(xì)胞周期分析胃癌細(xì)胞SGC790l-VCR的多藥耐藥性，用堿性磷酸酶免疫組織化學(xué)、反轉(zhuǎn)錄PCR等技術(shù)和Westem blot實(shí)驗(yàn)，檢測SGC7901-VCR細(xì)胞中有關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果表明，低劑量姜黃素可以逆轉(zhuǎn)SGC7901ⅣCR的多藥耐藥性，提高化療藥物長春新堿的抗胃癌作用。
3.4 增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷力
NK細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，作用于腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等靶細(xì)胞后啟動(dòng)其殺傷活力。姜黃素與其他抗癌藥物聯(lián)合使用，能夠通過增加天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)而提高原抗癌藥物的治療效果。Halder等[24]通過小鼠模型與人源化的免疫系統(tǒng)，得出姜黃素與-3脂肪酸和抗氧化劑或與RvD1(resolvin D1, 消退素)能顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞對胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞的殺傷效果，并且能預(yù)防自身被降解。Fiala[25]通過實(shí)驗(yàn)也得出了姜黃素增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷作用的結(jié)論。姜黃素在抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，增強(qiáng)天然殺傷細(xì)胞的作用之后，即可在組織水平上，抑制腫瘤血管的形成。
4 抑制腫瘤血管生成
腫瘤組織中包含的血管，主要起營養(yǎng)、支持腫瘤細(xì)胞的作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)能促進(jìn)血管生成，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡等。姜黃素可以通過抑制VEGF的表達(dá)而抑制腫瘤血管的生成。李劍明等用荷瘤BALB/c鼠動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察小鼠體內(nèi)新生血管的形態(tài)，用異硫氰酸熒光素-葡聚糖示蹤技術(shù)觀測血管生成情況。丁志山等建立雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，李小江建立肺腺癌A549 SP細(xì)胞亞群荷瘤模型和肺腺癌A549 NON-SP細(xì)胞亞群荷瘤模型。汪叢叢等觀察姜黃素對肺癌細(xì)胞A549血管擬態(tài)生成，結(jié)果均表明，姜黃素通過抑制腫瘤血管生成而抑制腫瘤生長。
5 展望
姜黃素的抗腫瘤是近幾年的研究熱點(diǎn)。多數(shù)研究表明，姜黃素具有很好的抗腫瘤作用，能夠多途徑、多方向地抑制腫瘤。關(guān)于姜黃素抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)中，有的實(shí)驗(yàn)證明姜黃素對正常細(xì)胞無毒，但有部分實(shí)驗(yàn)并未證明其對腫瘤細(xì)胞的抑制有選擇性。人們對其一些潛在的功能特性及安全性問題還尚未完全了解，故姜黃素的安全性問題還需要進(jìn)一步的研究。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，姜黃素的抗腫瘤機(jī)制將會被進(jìn)一步揭示，其安全性問題也能得到進(jìn)一步解決。姜黃素將可能代替殺傷癌細(xì)胞同時(shí)對人體具有很大傷害的化療、放射的治療方法。
談宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A 的含量測定
宣痹洗劑是由威靈仙、紅花等藥材經(jīng)水煎煮制成的復(fù)方制劑，具有散寒除濕、活血止痛之功效，臨床用于治療痹癥寒濕閉阻、淤血阻絡(luò)證，癥見膝關(guān)節(jié)疼痛，局部畏惡風(fēng)寒、活動(dòng)不利、蹲起困難，下肢沉重，晨僵，舌淡苔白，脈弦;膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎見上述證候者。紅花為本方臣藥， 是菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，《本草綱目》中記載紅花有活血、潤燥、止痛、散腫、通經(jīng)之功效，因此備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。紅花所含成分主要為色素、黃酮類、揮發(fā)油、脂肪酸、酚酸等。其中羥基紅花黃色素A，是紅花活血化瘀有效成分之一，其在1993 年被Meselhy 等人首次分離得到，是紅花黃色素的主要成分，《中國藥典》2010 年版一部規(guī)定以其作為紅花中的代表性活性成分進(jìn)行含量測定， 多被用于紅花相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含測指標(biāo)。為保證藥品質(zhì)量，本研究對宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A 的含量測定進(jìn)行了研究，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了正丁醇萃取的前處理方法，結(jié)果表明，該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
1100 型高效液相色譜儀(UV 檢測器，美國Aglient公司);AE-240 型電子天平(瑞士Mettler 公司)。
1.2 試藥
羥基紅花黃色素A 對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111637-200502);宣痹洗劑樣品(批號：121201、121202、121203)由中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院制劑中心提供;甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為純凈水，其他試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
采用Waters Symmetry Shiled-RP18(150mm4.6mm，5 m)色譜柱，以0.1%磷酸甲醇-0.1%磷酸(29∶71)為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測波長403 nm，柱溫25℃。
2.2 對照品溶液的制備
精密稱取羥基紅花黃色素A 對照品適量，加25%甲醇制成每1 毫升含10.0 g 的溶液，搖勻，即得。
2.3 供試品溶液的制備
精密量取樣品50.0 mL，置分液漏斗中，加水飽和正丁醇60 mL，振搖萃取4 次，每次50 s，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)?5%甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL 棕色量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.4 正丁醇萃取方法研究
以羥基紅花黃色素A 的含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，以正丁醇用量、萃取次數(shù)、振搖時(shí)間為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平與結(jié)果見表1~3。因素主次關(guān)系依次為正丁醇用量萃取次數(shù)振搖時(shí)間，其中正丁醇用量對得率的影響極顯著，其次為萃取次數(shù)與振搖時(shí)間， 而振搖50 s 與振搖70 s 的萃取效果基本接近，為節(jié)省時(shí)間，故選擇50 s 作為振搖時(shí)間，因此確定最佳萃取條件為A3B3C2，即正丁醇用量60 mL，萃取4 次，每次振搖50 s。
2.5 陰性樣品溶液的制備
按處方比例與工藝制備不含紅花的陰性樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。在上述色譜條件下，對照品、樣品及陰性樣品的液相色譜圖見圖1。結(jié)果表明， 樣品中其他成分對羥基紅花黃色素A 的測定無干擾。
3.方法學(xué)考察
3.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取對照品溶液4、6、8、10、12、14 L，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量X(g)為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=917.17X+0.16，r=0.9997(n=6)。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A 進(jìn)樣量在0.04~0.14 g 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
3.2 精密度試驗(yàn)
精密吸取對照品溶液10 L， 連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，RSD 為1.73%，表明儀器精密度良好。
3.3 重復(fù)性試驗(yàn)
精密量取樣品6 份，分別按2.3項(xiàng)下方法，以上述最佳萃取方法制備供試品溶液，并按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 L，測定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果羥基紅花黃色素A 的平均含量為0.3757 g/mL，RSD 為2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。
3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一供試品溶液， 分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣20 L，測得峰面積的RSD 為1.8%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。
3.5 加樣回收率試驗(yàn)
精密量取已知含量(0.3757 g/mL)的同批樣品25 mL 共6 份，分別置分液漏斗中，精密加入對照品溶液(10.02 g/mL)各1.0 mL，分別按2.3項(xiàng)下方法，以上述最佳萃取方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 L，計(jì)算回收率。
3.6 樣品測定
取不同批次樣品5 份，分別按2.3項(xiàng)下方法，以上述最佳萃取條件制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 L，以外標(biāo)法計(jì)算得到其中羥基紅花黃色素A 的含量為0.39 g/mL，RSD 為1.5%。
4 討論
羥基紅花黃色素A 是紅花中主要成分之一，具有活血化瘀、通脈止痛等功效?，F(xiàn)代研究表明，羥基紅花黃色素A 可以擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善心肌缺血，降低血壓，保護(hù)脊髓出血/再灌注損傷，具有抗凝、抗血小板聚集和血管再通作用，能有效緩解不穩(wěn)定性心絞痛(UA)、降低纖維蛋白原濃度、清除自由基、控制心絞痛的發(fā)作及向心肌梗死的轉(zhuǎn)化、抗疲勞及耐缺氧等藥理作用。
目前，羥基紅花黃色素A 的提取、分離以及純化工藝得到了很大的改進(jìn)，且其在紅花中含量的定量分析方法先進(jìn)，體內(nèi)的藥物代謝方式也已明確。且其多項(xiàng)藥理作用雖然已有報(bào)道，但仍然是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，一方面是其在靶細(xì)胞及分子水平的作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步深入探究;另一方面是與其他中藥活性組分的配伍所產(chǎn)生的新療效及其作用機(jī)制需要在分子、細(xì)胞、整體動(dòng)物多個(gè)層次予以系統(tǒng)揭示。因此，這就需要對不同制劑中羥基紅花黃色素A 的提取、分離、純化等處理手段以及含量測定進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。
正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法是目前最常用的工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法，是部分因子設(shè)計(jì)的主要方法。正交試驗(yàn)以概率論、數(shù)理統(tǒng)計(jì)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)，利用標(biāo)準(zhǔn)化正交表安排試驗(yàn)方案，并對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析，最終迅速找到優(yōu)化方案，是一種高效處理多因素優(yōu)化問題的科學(xué)計(jì)算方法。正交設(shè)計(jì)法就是利用正交表處理多因素多水平試驗(yàn)的一種科學(xué)方法。該法能以盡可能少的試驗(yàn)次數(shù)， 獲得最滿意的試驗(yàn)結(jié)果，篩選出最佳試驗(yàn)條件， 找出影響試驗(yàn)結(jié)果的主要因素，從而為在醫(yī)藥科學(xué)研究中多因素多水平問題提供了科學(xué)的、合理的解決途徑，并日益廣泛地應(yīng)用于中藥研究中。在工藝條件的優(yōu)選工作中具有廣闊的應(yīng)用前景，只是在用正交設(shè)計(jì)法探討工藝條件時(shí)，受測試指標(biāo)及所選因素、水平的影響很大，這樣選擇科學(xué)合理的測試指標(biāo)、因素、水平就成了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的重要步驟，對能否獲得最佳工藝參數(shù)具有重要意義。本研究以宣痹洗劑為載體，以羥基紅花黃色素A含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到正丁醇最佳萃取條件為：正丁醇用量60 mL，萃取次數(shù)4 次，振搖時(shí)間50 s， 并測得其中羥基紅花黃色素A 的含量為0.39 g/mL。
在羥基紅花黃色素A 含量測定研究中，參照《中國藥典》2010 年版及相關(guān)文獻(xiàn)，對流動(dòng)相選擇與比例、柱溫、檢測波長等因素進(jìn)行了考察。因干擾峰的存在，對流動(dòng)相進(jìn)行調(diào)整，經(jīng)比較選定0.1%磷酸甲醇-0.1%磷酸(29∶71)為流動(dòng)相時(shí)最佳。羥基紅花黃色素A 是具有單查耳酮苷類結(jié)構(gòu)的化合物， 極性較強(qiáng)，且呈酸性， 在流動(dòng)相中加入少量磷酸以抑制其離解，可改善其峰形及分離效果。
劉亮等的研究結(jié)果表明，振搖時(shí)間對萃取效果無顯著性影響，而本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)振搖時(shí)間對萃取效果有顯著影響，這可能是因?yàn)檎駬u時(shí)間太短，樣品溶液不能與正丁醇充分混合，從而影響萃取效果所造成。而本研究結(jié)果亦顯示振搖時(shí)間為50 s 與70 s 時(shí)萃取效果接近， 這可能是振搖50 s 時(shí)樣品即與正丁醇充分混合，故選擇50 s 作為最佳萃取時(shí)間，在節(jié)省時(shí)間的同時(shí)，達(dá)到了最佳萃取效果。
通過預(yù)實(shí)驗(yàn)比對發(fā)現(xiàn)， 如未進(jìn)行正丁醇萃取，宣痹洗劑中其他成分對羥基紅花黃色素A 的干擾明顯，無法進(jìn)行含量測定，從而進(jìn)行萃取，而正丁醇萃取宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A 的過程是利用羥基紅花黃色素A 與雜質(zhì)在水與正丁醇2 種互不相溶的溶劑中的溶解度或分配系數(shù)之間的差異，通過多次分配而實(shí)現(xiàn)分離，而羥基紅花黃色素A 在水飽和正丁醇中具有較大溶解度，所以本試驗(yàn)用水飽和的正丁醇作為純化萃取的溶劑，具有純化效果好，操作簡便，用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。且羥基紅花黃色素A 是具有單查耳酮苷類結(jié)構(gòu)的化合物，其分子結(jié)構(gòu)中具有不穩(wěn)定基團(tuán)，在提取、分離、純化過程中易發(fā)生氧化、水解、聚合等反應(yīng)，將使其結(jié)構(gòu)、藥理作用等發(fā)生變化。
宣痹洗劑為北京中醫(yī)藥十病十藥入選項(xiàng)目，臨床效果顯著，但仍缺少相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，尤其是對其中主成分的含量測定方法尚無相關(guān)研究，本研究對其中羥基紅花黃色素A 的含量測定方法進(jìn)行了研究，為該藥的質(zhì)量控制提供了理論參考。
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