克隆技術(shù)論文(2)
克隆技術(shù)論文篇二
差異表達(dá)基因克隆技術(shù)的新進(jìn)展
提要 分離并克隆差異表達(dá)基因是 目前 功能性基因 研究 的熱點(diǎn)。mRNA差異展示是篩選差異表達(dá)基因最有效的技術(shù)之一,它的主要不足是有一定假陽性。RDA、SSH、DSD、LSH技術(shù)能夠克服假陽性,但也具有一定的不足,應(yīng)根據(jù)需要選擇運(yùn)用。隨著能擴(kuò)增長片段及具有自動(dòng)校正功能的Taq酶出現(xiàn)及 應(yīng)用 ,這些技術(shù)將會(huì)不斷完善與 發(fā)展 ,具有廣闊的應(yīng)用前景。
關(guān)鍵詞 差異表達(dá)基因;克隆
現(xiàn)代 分子生物學(xué)研究表明,人類基因組約由10萬左右的不同基因組成,這些基因選擇性的表達(dá)決定了機(jī)體整個(gè)生命過程,基因表達(dá)的變化處于控制生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制的中心位置。因此,分離并克隆差異表達(dá)基因不僅有助于闡明生命的粵秘,而且還能為基因診斷與 治療 提供重要的 理論 依據(jù)。近幾年來,差異表達(dá)基因克隆技術(shù)不斷完善與發(fā)展,已成為研究腫瘤和疾病等相關(guān)基因的重要手段。
一、mRNA差異展示
mRNA差異展示(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前篩選差異表達(dá)基因最有效的 方法 之一,其基本原理是:3´端采用錨定引物,與mRNA3´poly a結(jié)合,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,形成mRNA:cDNA雜交分子,5´端采用20條隨機(jī)引物,與錨定引物一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序膠顯示出來,再回收鑒定克隆差異條帶。1992年Liang和Pardee[1]建立此技術(shù)時(shí),5´端采用20條隨機(jī)引物,每條由10個(gè)堿基組成,3´端采用12條引物即T12MN(M=A、C或G,N=A、G、C、T)。這種組合從統(tǒng)計(jì)學(xué)上幾乎能完全覆蓋所有的mRNA序列,差異表達(dá)的基因會(huì)全部呈現(xiàn)出來。實(shí)踐證明,這種方法有效,但假陽性率在50%~70%左右,差異條帶在Northern印跡上重現(xiàn)性差,后續(xù)處理也比較復(fù)雜。1994年Ito[2]等對(duì)3´端引物進(jìn)行了改進(jìn),把12條引物改為3條,即T12A、T12C、T12G,使得實(shí)驗(yàn)操作簡化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端錨定引物與5´端隨機(jī)引物上皆增加10個(gè)堿基,使得上下游引物Tm值在60℃左右,PCR循環(huán)參數(shù)也改為前5個(gè)循環(huán)采用Liang和Pardee推薦的參數(shù),即94℃30s,40℃2min,72℃30s。經(jīng)這樣改進(jìn),顯著地增強(qiáng)了差異條帶的重復(fù)性和敏感性,同時(shí)使得差異條逼帶的克隆十分方便。1996年4月,Liang和Pardee[4]對(duì)5´端此物進(jìn)行了改進(jìn),引物條數(shù)改為8條,皆帶上HindⅢ酶切位點(diǎn),每條由13個(gè)堿基組成,3´端錨定引物采用3條,也帶上HindⅢ酶切位點(diǎn),每條由18個(gè)堿基組成,PCR循環(huán)條件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40個(gè)循環(huán),最后在72℃延伸7min。1998年[5]我們?cè)贚iang和Pardee改進(jìn)的基礎(chǔ)上,對(duì)PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行了改進(jìn),即前5個(gè)循環(huán)采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35個(gè)循環(huán)采用94℃30s,55℃2min,72℃30s,最后在72℃延伸7min。經(jīng)這樣改進(jìn),既保持了擴(kuò)增效率,又增強(qiáng)了差異條帶的特異性及重復(fù)性,降低了假陽性率。
總之,mRNA差異展示具有簡便、快速、所需起始材料少、同時(shí)可在多個(gè)材料之間或不同處理材料之間進(jìn)行比較等優(yōu)點(diǎn),但具有較高頻率的假陽性和短小的差異片段的缺點(diǎn),給后續(xù)處理帶來一系列 問題 ,雖然此技術(shù)經(jīng)過了一些起改進(jìn),但這兩個(gè)缺點(diǎn)仍限制著此方法的充分應(yīng)用。
二、代表性差示 分析
代表性差示分析(representational difference analysis,RDA)最早由Lisitsyn等提出的。1994年,Hubank和Schatz[6]將其應(yīng)用于克隆差異表達(dá)基因,其基本原理是:靶方(Tester,T)和驅(qū)動(dòng)方(Driver,D)的cDNA在進(jìn)行差方式分析前均用一種識(shí)別4堿基序列的限制酶作切割處理,形成平均長度為256bp的cDNA片段代表群,第一次T與D雜交反應(yīng)時(shí),兩者總量比為1:100,第二次增加到1:400,第三次增加到1:8000,再利用PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈模板,而僅以線性形式擴(kuò)增單鏈模板這一特性,通過降低cDNA群體復(fù)雜度和多次更換cDNA兩端接頭,來特異擴(kuò)增目的基因片段。特別是T減D雜交反應(yīng)后僅設(shè)置了72℃ 復(fù)性與延伸及95℃變性這兩個(gè)循環(huán)參數(shù),共20個(gè)循環(huán),從而使PCR產(chǎn)物特異性大大提高。此技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是差異條帶在Northern印跡上重現(xiàn)性好,假陽性少。缺點(diǎn)是所需起始材料較多,更多信賴于PCR技術(shù),T與D之間若存在較多差異,或T中存在某些基因上調(diào)表達(dá),則難達(dá)到預(yù)期目的,而且工作量比DDRT-PCR大,周期長。
三、抑制性扣除雜交
抑制性扣除雜交(suppression subtractive hybridization,SSH),是1996年Diatchenk[7]等提出的一種新的克隆基因技術(shù),其基本原理是:先將T與D方cDNA用限制酶切割為小片段,將T方平均分為兩份,分別連接不同的接頭,然后與過量的D方cDNA進(jìn)行不充分雜交。根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理,濃度高的單鏈分子迅速復(fù)發(fā),而濃度低的單鏈分子仍以單鏈形式存在。然后混合兩份雜交樣品,同時(shí)加入新的變性D方cDNA進(jìn)行第二次扣除雜交,雜交完全后補(bǔ)平末端,加入合適引物接頭(接頭1與接頭2引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。當(dāng)DNA兩條鏈含相同接頭時(shí),其PCR擴(kuò)增受到抑制,而含不同接頭的雙鏈DNA分子才可進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增,其產(chǎn)物即為目的片段。
此技術(shù)避免了消減雜交過程中分離單雙鏈DNA的步驟,可成千倍地?cái)U(kuò)增目的片段,能分離出T方上調(diào)表達(dá)的基因,與DDRT-PCR相比,具有假陽性少重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),它的最大不足就是需要較多的起始材料,更多依賴于PCR技術(shù),不能同時(shí)進(jìn)行數(shù)個(gè)材料之間或不同處理材料之間的比較。
四、差異消減展示
差異消減展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等[8]提出的,它是在DDTR-PCR呈現(xiàn)出差異條帶之后,同時(shí)回收差異條帶與對(duì)照方的相應(yīng)范圍的條帶,靶方回收的差異條帶用非生物素標(biāo)記的引物與dNTPs進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而對(duì)照方回收的差異條帶用含生物素標(biāo)記的dATP的dNTPs進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物進(jìn)行消減雜交,用鏈親和素去除共有的產(chǎn)物,剩下的產(chǎn)物由帶有α-32P dATP的dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增,再重復(fù)差異展示,回收差異條帶并克隆。此技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是獲得差異條帶在Northern印跡上重現(xiàn)性好,假陽性少,敏感性強(qiáng),可獲得長片段,起始材料要求少,可獲取低豐度差異表達(dá)基因,缺點(diǎn)是步驟繁瑣,工作量大,周期性長,更多依賴于PCR技術(shù)。
另外,趙忠良博士把長片段PCR擴(kuò)增(LPCR)與消并減雜交技術(shù)結(jié)合起來,建立了LPS技術(shù),并運(yùn)用此技術(shù)從抗原呈細(xì)胞中獲取了170多個(gè)差異表達(dá)基因。此技術(shù)的基因原理是:T與D方分離出cDNA后,運(yùn)用5´端帽子引物與3´端錨定引物,對(duì)cDNA進(jìn)行大量擴(kuò)增,其產(chǎn)物直接進(jìn)行消減雜交,然后過柱子,去除相同的基因,剩余的部分再與D方cDNA進(jìn)行二輪消減雜交,再過柱子,去除非差異部分,剩下的差異部分進(jìn)行第三輪消減雜交,其產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分段克隆。這種 方法 最大的好處是:起始材料需要少,可獲得差異基因,假陽性少,有可能獲得全長差異表達(dá)基因。
總之,隨著高效擴(kuò)增的Taq酶與具有自動(dòng)校正功能的Taq酶的出現(xiàn),長片段PCR擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化,差異表達(dá)基因克隆技術(shù)將會(huì)不斷 發(fā)展 ,但 目前 主要有以上幾種方法,各有其優(yōu)缺點(diǎn), 研究 者應(yīng)根據(jù)自己的實(shí)際情況,選擇合適的技術(shù)方法,以其達(dá)到自己預(yù)期的目的。
參考 文獻(xiàn)
1 Liang P et al.Science,1992:257(14):967
2 Ito T et al.FEBS letters,1994;351:231
3 Ayala M et al.Biotechniques,1995;18(5):842
4 GenHunter Corporation,RNA imageTM,kit(cat NO.G501) for mRNA diflerential& nbsp;display,1996,April,12
5 Cui DX et al.Journal of the Fourth Military university,1998;18(6):601
6 Hubank M et al.NuclEic Acids Res,1994;22:5640
7 Diatchenko L et al.Proc Natl Sci USA,1996;93:6025
8 Jose RP et al.Analytical Biochemistry,1998;257:161
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