超高壓滅活流感病毒的免疫原性研究
【摘要】
目的 檢測超高壓滅活的流感病毒FM1株的免疫原性。方法 采用超高壓技術(shù)(300 mPa，2.5 h)滅活甲型流感病毒FM1株。取ICR小鼠60只，用于病毒免疫性實驗及免疫保護試驗各30只。分別進行抗體檢測、T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，并計算感染后小鼠的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。結(jié)果 壓力滅活組和病毒對照組小鼠抗體產(chǎn)生量、T淋巴細胞刺激指數(shù)均顯著高于正常對照組(P<0.01);壓力滅活組小鼠肺指數(shù)顯著低于病毒對照組(P<0.01)。結(jié)論 超高壓技術(shù)滅活的流感病毒FM1株保留了很好的免疫原性。
【關(guān)鍵詞】 超高壓;流感病毒;免疫原性
疫苗接種是當今防止流感發(fā)生和流行最有效的一種手段〔1〕。在我國目前使用的流感疫苗為第一代疫苗，其中全病毒滅活疫苗雖然免疫效果好，但因為發(fā)生副反應的幾率高，且存在制備過程復雜和安全性等問題不適宜兒童和老年人接種。超高壓(High Hydrostatic Pressure，HHP)是指超過100 mPa的壓力，作為一種有效的滅菌消毒的物理手段已成功地應用于生物工程的多個領域〔2～4〕，采用超高壓技術(shù)滅活病毒可以提供一個完整的病毒顆粒，這種病毒顆粒不僅喪失了原來的感染性且很好的保持了病毒的免疫原性，制備過程簡單，不添加化學制劑，在一定程度上降低了副反應的發(fā)生。國外已用該技術(shù)開展了動物疫苗的研制工作〔4，5〕，但用于流感疫苗的研究尚未見報道。
本課題組已經(jīng)采用超高壓技術(shù)滅活了流感病毒FM1株，并已確定了其滅活的適宜條件〔6〕。本研究采用超高壓滅活的流感病毒免疫小鼠，檢測其免疫效果，從而為進一步探討用超高壓方法制備流感疫苗的可行性提供實驗依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 動物 ICR小鼠共60只，雄性，4 w齡，18～22 g,購自吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心。分別用于病毒免疫性實驗(30只)和免疫保護試驗(30只)，均在相同條件下飼養(yǎng)。
1.2 主要試劑及儀器 細胞營養(yǎng)液(IMDM)、小牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、MTT、ConA、弗氏完全佐劑和HRP?羊抗鼠IgG均為美國Sigma公司產(chǎn)品。EDTA和 ELISA用試劑為鼎國生物制品公司產(chǎn)品。OLYMPUS?CKX41倒置顯微鏡，蘇泰集團BHC?1300ⅡA/B3生物安全柜，日本三洋MCO?17AIC CO2培養(yǎng)箱和MDF?U4086S型超低溫冰箱。TECANA?5082酶標檢測儀，上海超高壓儀器廠700?0.55×1.5型靜壓機。
1.3 細胞株及病毒株 流感病毒鼠肺適應株FM1和MDCK細胞株由吉林大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室分子病毒研究室保存。經(jīng)MDCK細胞擴增后，病毒裝入無菌塑料袋，放入用于超高壓的靜壓機，在300 mPa，保壓2.5 h進行病毒的滅活，滅活的流感病毒分裝后，放入-70℃保存，待用。
1.4 病毒免疫性實驗 30只ICR小鼠隨機分為壓力滅活組、病毒對照組和正常對照組，每組10只，超高壓滅活病毒組每只皮下注射經(jīng)超高壓滅活的病毒0.2 ml(病毒與弗氏完全佐劑1∶1混合)，病毒對照組每只皮下注射病毒液0.2 ml(病毒與弗氏完全佐劑1∶1混合)，正常對照組每只皮下注射等量生理鹽水，服次免疫后5 d處死小鼠，收集血液分離血清，無菌取脾臟，用于抗體檢測和T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。
1.5 抗體檢測 采用間接ELISA法，將免疫后壓力滅活組和正常對照組的小鼠血清均進行倍比稀釋，按實驗步驟，反應終止時，測OD492值。
1.6 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 采用MTT法，無菌取小鼠脾臟，調(diào)細胞濃度為5×106/ml，加入ConA 0.1 ml/孔，培養(yǎng)48 h，再加人MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，繼續(xù)孵育4 h，加人DMSO 100 μl/孔，測OD570值，按下述公式計算刺激指數(shù)(SI)：SI=ConA刺激孔OD值/對照孔OD值。
1.7 免疫保護試驗 另用30只ICR小鼠隨機分成正常對照組、病毒對照組和壓力滅活組，每組10只。其中壓力滅活組小鼠皮下注射0.2 ml滅活流感病毒(病毒與弗氏完全佐劑1∶1混合)，其他兩組同時注射等量生理鹽水。第二次免疫后5 d，正常對照組小鼠每只以0.2 ml生理鹽水滴鼻，其他兩組以0.2 ml未經(jīng)超高壓處理的流感病毒液滴鼻感染小鼠，感染后7 d，各組小鼠稱重，脫頸處死，取肺，計算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。肺指數(shù)=肺重量(g)/體重(g)×100;肺指數(shù)抑制率=病毒對照組平均肺指數(shù)-實驗組平均肺指數(shù))/病毒對照組平均肺指數(shù)×100%。
1.8 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用x±s表示，應用t檢驗進行比較。
2 結(jié) 果
2.1 抗體檢測結(jié)果 間接ELISA結(jié)果顯示，小鼠再次免疫5 d后，在1∶3 200～1∶25 600血清稀釋度，壓力滅活組和病毒對照組的抗體含量與正常對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，見表1。
2.2 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果 壓力滅活組和病毒對照組T淋巴細胞SI分別為2.92±0.31及2.89±0.21，與正常對照組(1.73±0.17)比較有顯著性差異(P<0.01)。
2.3 免疫保護試驗 壓力滅活組小鼠肺指數(shù)為0.723±0.16，肺指數(shù)抑制率為37.4%，與病毒對照組肺指數(shù)(1.155±0.14)比較有顯著性差異(P<0.01);正常對照組(0.656±0.049)與病毒對照組比較也有顯著性差異(P<0.01);壓力滅活組與正常對照組比較無明顯差異(P>0.05)。 表1 加強免疫5 d三組不同血清稀釋度的抗體水平
3 討 論
國內(nèi)外學者對許多動物病毒研究表明，超高壓可以通過使病毒表面結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變而使其感染性喪失，但超高壓只改變蛋白質(zhì)類抗原物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，保留了一級結(jié)構(gòu)的完整性，沒有引起共價鍵的破壞，而蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中共價結(jié)構(gòu)的完整性是其免疫原性所必需，因此超高壓后病毒的抗原決定簇沒有丟失，所以仍具有與未經(jīng)超高壓處理的病毒一樣的免疫原性〔7，8〕。
本文采用超高壓技術(shù)滅活流感病毒FM1株，并對其免疫原性進行了檢測?？贵w檢測結(jié)果表明用超高壓處理的病毒免疫小鼠，其特異性抗體產(chǎn)生量與正常對照小鼠之間存在顯著差異，與未經(jīng)超高壓滅活的病毒組產(chǎn)生的抗體效價相近，表明用超高壓處理的流感病毒FM1株免疫小鼠，產(chǎn)生了有效的體液免疫應答，而且與未經(jīng)超高壓處理的病毒相比免疫原性沒有改變。T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗可以間接體現(xiàn)T淋巴細胞識別特異性抗原的能力。用超高壓滅活的病毒免疫后的小鼠淋巴細胞的刺激指數(shù)顯著增高，表明在超高壓滅活病毒的作用下，小鼠T淋巴細胞具有較強的增殖分化能力。
本文用免疫保護試驗進一步證實了超高壓處理的流感病毒FM1株的免疫效果。流感病毒感染可引起小鼠病毒性肺炎，炎性滲出使肺重量增加，肺重量增加與肺炎的嚴重程度呈正相關(guān)，結(jié)果顯示超高壓處理的病毒組肺指數(shù)顯著低于病毒對照組，但與正常對照比較無顯著差異，證實了超高壓處理的流感病毒FM1株保留了與未經(jīng)超高壓處理病毒相似的免疫原性，誘導機體產(chǎn)生了針對流感病毒有效的特異性的免疫應答，清除了入侵的流感病毒，有效的避免了小鼠病毒性肺炎的發(fā)生。
長期以來熱力、化學等方法在疫苗制備上一直被普遍應用，但這些技術(shù)都存在一些弊端〔9，10〕，例如對病毒結(jié)構(gòu)破壞較大，化學制劑的副作用等。由于超高壓比熱力和化學因素更易控制，作用溫和，因此滅活病毒不會引起表面抗原的過度變性或抗原決定簇的丟失，而且完整病毒顆粒的免疫效果更接近于有感染性的病毒體，因此超高壓技術(shù)滅活的病毒，如用于疫苗的生產(chǎn)，將會帶來更有效的免疫，為將來探討用超高壓技術(shù)制備全病毒滅活疫苗提供了可供參考的實驗數(shù)據(jù)。
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